过程动态超分辨成像面临的科学问题是：如何调控“亮-暗”开关速度和发光亮度来协同提高空间和时间分辨率，如何获得可逆且多次的荧光“亮-暗”开关以实现多次成像，如何使可逆荧光开关具备长时间反复“亮-暗”开关的能力以实现过程的成像。

遵循化学热力学和动力学规律，荧光开关染料要实现可逆的“亮-暗”开关反应，必然包含一个自由能升高的过程，这就需要外部补充自由能。两位诺贝尔奖获得者Stefan. W. Hell教授和William E.Moerner教授采用的方法（Angew-2007-6266; JACS-2014-14003），是先调控染料由“暗”分子转变为“亮”分子后，再用高功率激光将“亮”分子永久漂白回复到“暗”分子，这造成了一个荧光开关只能成像一次，因此无法动态成像。同时，开关过程的活化能难以调控，使得“亮”和“暗”分子存在的寿命不受调控，时间分辨也难以提高。

针对过程动态超分辨成像中的科学问题和技术难题，经过多年研究，我们发现了荧光分子取代基位置效应，发现了TICS机制，建立了量化TICT和评价PET的方法，从而原创性地发展了“分子内氢键调控的交叉离域荧光团”，获得了多次自发可逆开关荧光染料，并通过一系列精细结构调控，先后协同提高了发光亮度、开关速度、大幅度延长了开关寿命，最终实现了研究单元全景时空超分辨四维荧光成像。

（1）抑制交叉共轭

染料构效关系研究发展抑制交叉离域荧光染料：通过结构刚性化抑制荧光染料激发态交叉离域的形成，我们开发了具有高亮度、高光稳定的新型荧光团，提升了单分子定位精度与超分辨成像的时空分辩。

扭转的分子内电荷转移（TICT）是荧光染料激发态的一种光物理现象，它的形成会诱导交叉离域结构的产生，导致荧光淬灭。我们将三元环的氮丙啶结构引入不同荧光染料母体中，通过三元环强大的环张力有效抑制了TICT态的形成与交叉离域结构的产生，大幅提升了不同染料母体的量子产率与稳定性，量子产率由0.009提升至0.71（J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 6960）

为进一步判断、量化TICT过程形成的交叉离域结构，我们归纳了13种荧光染料不同类型的S1势能面，发现在S1势能面上，当旋转势垒（E_RB）较高，驱动能（E_DE）较大时，分子会倾向于保持亮态（LE或者ICT态），而不易形成TICT；当E_RB为正值，E_DE为负值时，分子会部分形成TICT；E_RB为零且E_DE为负值时，分子会容易跃迁到TICT态，大幅淬灭荧光。由此，可以根据E_RB和E_DE来量化荧光染料TICT态，进一步指导高亮度、高稳定性的超分辨荧光染料的构建（Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 10160）。此外，我们发现交叉离域结构的调控可以有效控制染料的发光性能，以此发现了新电荷转移机制TICS（激发态电荷穿梭），用于构建大斯托克斯位移（LSS）超分辨荧光染料。在罗丹明类、Bodipy的meso-位引入伯胺、仲胺后，染料在激发态形成的交叉离域结构促使斯托克斯位移达到70 nm以上（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 7073）。而协同TICT与氢键作用，我们开发了单本环的近红外染料，利用分子量最小的近红外荧光团实现了活细胞内脂滴、分子筛染色的超分辨成像（J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 5258.）。

基于上述抑制荧光团交叉共轭的策略，进一步衍生获得了高亮度的涵盖全光谱的22种荧光团，并申请了140项专利（包括一项PCT），目前已授权47项。这一系列新型荧光染料适用于STED超分辨显微镜对光稳定性的要求，协同提高空间分辨率，

（2）发展自闪烁荧光开关实现动态超分辨荧光成像，系统提升时空分辨

我们巧妙地引入分子内氢键来稳定螺酰胺结构，大大加快了关环反应的速度，获得了一类无需光激活的可逆自闪荧光开关。多次的反复荧光开关实现了毫秒级分辨，加之优异的开关疲劳度，在活细胞内实现了细胞器的动态时空超分辨成像。分子内氢键的存在，使得这类开关免受pH等环境因素的干扰，并获得匀质闪烁的性能，普适于广泛的生理条件（Chem. Sci.2019, 10, 4922）。

进一步研究发现，这类自闪开关环物种稳态下的吉布斯自由能的差值（ΔG_C-O）同开环比例具有优异的线性关系（R²= 0.965），利用此线性关系实现了定量地指导设计多种颜色的自闪超分辨荧光探针（Angew. Chem. Int. Ed.2020, 59, 20215）。

我们将邻甲基吡啶引入到罗丹明螺酰胺中，开发的匀质闪烁动态超分辨染料LysoSR-549，在10 nm/ 20ms时空分辨率下对全细胞溶酶体实现了40分钟的单分子超分辨成像。在单个溶酶体分辨的水平上解析了全细胞内所有溶酶体的运动轨迹，观察到最长运动距离可达50μm，最快运动速度可达0.31μm/s。（Angew. Chem. Int. Ed.,2022, 61,e202202961.Hot paper）。

尽管自闪烁荧光探针在超分辨成像中展现出重要应用潜力，其仍面临着成像背景高等挑战。例如，由于细胞内存在未反应或非特异性结合的自闪烁探针，这些探针同样会表现出自发闪烁特性，会产生强烈的背景信号并严重干扰目标分子的定位，降低了成像的定位准确度。而随着分辨率的不断提高，尤其是当接近1 nm时，背景信号的问题将变得更加突出，成为制约超分辨成像技术进一步发展的关键因素。我们团队发展了一种“靶控自闪烁”荧光探针，并将其命名为“Blinkogenic Probe”。这类探针只有在识别靶标后才会激活自闪烁荧光开关性能，排除了非靶向单分子定位的干扰，提升了单分子超分辨成像的定位准确性，实现了活细胞内免洗动态单分子超分辨成像。(Angew. Chem. Int. Ed.2024, e20241746)